液相色譜儀流動相的選用要求
　　液相色譜儀流動相的選用要求包括流動相性質(zhì)要求、流動相選擇、流動相pH值、流動相脫氣、流動相過濾、流動相貯存、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問題和HPLC用水等方面。
　　一、流動相性質(zhì)要求：
　　HPLC中，強溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k值減??；較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附增加，相應(yīng)的容量因子k值增大。因此，k值是流動相組成的函數(shù)。理論塔板數(shù)一般與流動相的粘度成反比。
　　1、流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：
　　低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。
　　堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。
　　酸性流動相不能用于氧化鋁和氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
　　2、純度高：
　　色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。
　　3、必須與檢測器匹配：
　　當(dāng)使用UVD時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收或吸收很小。
　　當(dāng)使用RID時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
　　4、粘度低：
　　高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴散和傳質(zhì)，使柱效降低，還會使柱壓增加，分離時間延長。選擇沸點在100℃以下的流動相。
　　5、對樣品的溶解度要適宜：
　　如果溶解度欠佳，樣品會在色譜柱內(nèi)沉淀，不但影響純化分離，而且會使色譜柱惡化。
　　6、樣品易于回收：
　　應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
　　二、流動相選擇：
　　HPLC中，溶劑的洗脫能力與溶劑極性相關(guān)。
　　1、正相色譜的流動相：
　　在正相色譜中，溶劑強度隨極性的增強而增加。
　　正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。
　　2、反相色譜的流動相：
　　在反相色譜中，溶劑強度隨極性的增強而減弱。
　　反相色譜的流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑（如甲醇、乙腈和四氫呋喃等）。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇－水系統(tǒng)滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小，價格低，是反相色譜zui常用的流動相。
　　乙腈－水系統(tǒng)與甲醇－水系統(tǒng)相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，可滿足在紫外185～205nm處檢測的要求，綜合來看，乙腈－水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)。
　　在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，需采用梯度洗脫。
　　三、流動相pH值：
　　采用反相色譜分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相pH值，以抑制樣品組分的解離、增加組分在固定相上的保留和改善峰形的技術(shù)，稱為反相離子抑制。
　　1、弱酸樣品：
　　對于弱酸樣品，流動相pH值越小，組分k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸pKa值時，弱酸主要以分子形式存在。
　　分離弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液。
　　2、弱堿樣品：
　　對于弱堿樣品，情況與弱酸樣品相反。
　　分離弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
　　流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象，在這種情況下有機胺（如三乙胺）稱為減尾劑或除尾劑。
　　四、流動相脫氣：
　　1、流動相脫氣的原因：
　　HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵工作、柱分離效率、檢測器靈敏度和基線穩(wěn)定性，甚至無法檢測。
　?。?）流動相中的溶解氧可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。
　?。?）溶解氧會引起溶劑pH變化，給分析結(jié)果帶來誤差。
　　（3）溶解氧能與某些溶劑（如甲醇和四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），導(dǎo)致檢測靈敏度輕微降低，更重要的是在梯度洗脫時會造成基線漂移或形成鬼峰。除去溶解氧將大大提高UVD的性能。
　　（4）在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛和酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。除去溶解氧將改善在一些熒光檢測中的靈敏度。
　　（5）在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），溶解氧的影響更大。
　　2、常用脫氣方法：
　　有吹氦脫氣法、加熱回留法、超聲波脫氣法、抽真空脫氣法和在線真空脫氣法等。
　　五、流動相過濾：
　　所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm或0.22μm濾膜過濾，以除去雜質(zhì)微粒。色譜純試劑也不例外，除非在標(biāo)簽上標(biāo)明已過濾。
　　用濾膜過濾時，要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。
　　有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或過濾不動。
　　水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機溶劑。否則濾膜會被溶解，溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。
　　對于混合流動相，可在混合前分別過濾。如需混合后過濾，有機相濾膜?，F(xiàn)已有混合型濾膜。
　　六、流動相貯存：
　　流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因為許多有機溶劑（如甲醇和乙酸等）可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑被污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，防止氧和二氧化碳溶入流動相。
　　磷酸鹽和乙酸鹽緩沖液很容易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新過濾。
　　容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的容器，以除去容器底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的容器無此現(xiàn)象。
　　七、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問題：
　　1、鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。
　　2、鹵代溶劑與水的混合物比較容易反應(yīng)，不能存放太久。
　　3、鹵代溶劑（如CCl4和CHCl3）等與各種醚類（如二異丙醚和四氫呋喃等）混合后，可能會反應(yīng)生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動相應(yīng)盡量不采用或新鮮配制。
　　4、鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，會產(chǎn)生結(jié)晶。
　　總之，鹵代溶劑新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產(chǎn)生類似問題。
　　八、HPLC用水：
　　HPLC應(yīng)用中要求用超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。